请选择 进入手机版 | 继续访问电脑版

优米医谷

快捷导航
查看: 51|回复: 5

大肠杆菌系统中优化表达重组蛋白之先进技术

[复制链接]
  • TA的每日心情
    奋斗
    2 小时前
  • 签到天数: 14 天

    [LV.3]偶尔看看II

    24

    主题

    68

    帖子

    216

    积分

    超级版主

    Rank: 20Rank: 20Rank: 20Rank: 20

    积分
    216
    发表于 2018-9-15 12:18:26 | 显示全部楼层 |阅读模式
    本帖最后由 枫儿 于 2018-9-15 17:00 编辑

    摘要:
    原核表达系统在表达有价值的重组蛋白、酶及治疗性制品方面是有优势的。传统的微生物技术已经逐步进化并与先进的技术合并,以求为了促进产品代谢产物、重组生物制品、工业化酶的表达。近来,一些先进的手段已经应用于细菌表达平台以促进重组蛋白的表达。这些方法包含使用强激活子的代谢工程,新型的载体颗粒,例如:诱导剂、增强剂、蛋白标签、分泌物信号、克隆用的高通量设备以及筛选过程和发酵技术。大肠杆菌中新技术的改进导致不容易表达复合产物,包括小肽、抗体片段、少量蛋白以及大量的全序列糖基化单克隆抗体。Wacker的分泌技术,诱导物、无细胞系统、翻译后修饰的菌株工程,如二硫键的连接和细菌的N端糖基化,在大肠杆菌中表达复合蛋白和多肽的有效性方面仍需评估。
    本文提供了一个概念:近来较为流行的在大肠杆菌中提高外源蛋白表达的表达技术,最为重要的是在微生物和生物制药中的应用。
    前言
    很多微生物制品具有重要的工业和研究价值;然而它们从自然界不容易获得。大肠杆菌的重组DNA技术提供了一个高表达水平和可放大的过程的很有潜力的方法,此方法的成本低廉。
    任何生物制药的商业化的成功依赖于其可大量表达重组制品的有效放大的能力。其次,随着放大产品产量的增加,成本可最小化。使用生物基因学改造的重组蛋白制品的制备过程需要:1、选择一个合适的克隆载体、克隆元素和宿主;2、稳定的、高产量、高表质量的重组克隆代次;3、可放大的、一致的、高产量的及优化的发酵过程;4、低成本和便捷的纯化过程。
    在制备重组蛋白方面,大肠杆菌是最优的表达系统(图1).由于使用新型的诱导剂,诱导后蛋白在短短的6小时内过表达。据报道,大肠杆菌可以以折叠的、可溶的、功能性的形式表达人变异型基因工程溶菌酶,而且只需一步纯化过程。
    大量数据表明,大肠杆菌表达系统在表达重组蛋白方面是一个高表达系统。例如单序列的结合以及Wacker分泌技术:提高蛋白在大肠杆菌周质腔和胞外分泌表达的效率。在N段或C端加不同的标签(Fh8, SUMO, His, TRX and BMP标签)以增强蛋白的可溶性和纯化亲和力。随着细菌培养温度30, 28, 23, 10, 15 或 4C逐步降低,表达蛋白的可溶性显著增加。此外,低温可以增强蛋白的稳定性和正确折叠。密码子的最优化可成倍增强蛋白表达。先进的高通量筛选设备和优化发酵过程可以提高蛋白表达。实现DOE(实验设计)和在最新型的迷你反应器中优化上游过程,可大大缩短研发时间并使蛋白表达量成倍增加。使用通用的严格控制的表达体系,新型的激活子和大肠杆菌糖工程细胞,可以确保高水平表达出需要的重组制品。而且,对于宿主/菌株、载体、过程和提高重组制品表达效率新技术的改进还有继续开发的余地。
    一种常用的宿主:大肠杆菌
    大肠杆菌无论在学术界还是生物制药工业界都是一种最常用的重组蛋白表达系统,由于其遗传学性质已被熟知。很多在世界范围内已被广泛应用于临床的生物药物(表1)都是由大肠杆菌表达的。


                                                                                                                             图1:常规蛋白制造流程
                                                                                              表1  被批准的治疗性生物蛋白和它们的临床适应症的最新列表



    大肠杆菌表达系统较其它表达系统具有多种优势,因为其细胞生物学性质已经被熟知,易于操作,简单的发酵过程,以及低成本制造和可大量表达重组蛋白。在最近的研究中,大量的治疗性蛋白和工业化酶使用大肠杆菌作为宿主来表达(表2)。在大肠杆菌中,目标蛋白可以在胞内以不可溶的蛋白聚合物的形式表达为包涵体,还表达为可溶的分泌型蛋白。
    这种表达系统的其它缺点为,重组制品的制备为非功能状态,这是因为在大肠杆菌中不能进行翻译后修饰。如果蛋白以包涵体的形式表达,下游过程是十分繁琐的。在大肠杆菌中包涵体的形成是由于所需细胞器的缺失以及外源蛋白在细胞质中的过表达。为了克服这是挑战,在大肠杆菌的周质腔或者在胞外空间通过合并合适的信号肽序列来表达重组蛋白,这种表达方式可以使蛋白正确折叠并可使蛋白水解尽量降到最低。这种信号序列可以从自然界获得,也可以通过先进的生物信息学工具设计合成。大肠杆菌BL21(DE3)和K12宿主已被广泛用于制造各种生物药制品。
    这里有多种分子工具和方法可以高水平表达外源蛋白,例如大量的表达质粒,工程宿主和生长培养策略。大肠杆菌可用于表达从低分子量蛋白到相对的高分子量蛋白以所需产量。然而,困难的表达蛋白时,这就不适用。
    提高大肠杆菌表达水平的最新技术
    很多新型的技术和高产量方法用于大肠杆菌的克隆和过程的改进。更大的挑战在于发展快速的可放大的重组蛋白和酶的生产过程。预测最佳的表达系统是不切实际的,载体颗粒、分泌信号、蛋白生产条件以及基于外源蛋白特性的发酵过程。虽然对于重组蛋白制品来说,大肠杆菌表达是最佳的表达系统,它不能像真核宿主那样,以分泌的形式制备正确折叠的具有活性的蛋白。结果是,以下在本文中描述多种方法和平台技术在大肠杆菌中表达目标蛋白。一些先进的技术(图2)在大肠杆菌中用来表达更好质量和大量的外源蛋白也有所描述。新型技术与传统技术相比存在的一些优势和劣势在表3中有所描述。
    在大肠杆菌中的密码子最优化基因表达
    在工程宿主中功能蛋白的有效表达是各种新型平台技术的首要基础。不幸的是,当表达宿主过量转化时,基因不会得到有效表达,这是因为在不同的生物体中有不同的密码子序列。近些年已经证实,密码子的替换显著影响蛋白折叠和基因表达水平。
    合成生物学的基础技术的目标在于创造一个包含合成和设计基因的改良生物体,其用于制造重组治疗性蛋白,工业酶和生物燃料。使用标准生物学和受控的因素来建立各种新型的平台,包括诱导物、激活子、核糖体结合位点(RBSs)、转录终止剂等。进一步讲,合成生物学提供了过多的基因要素,如激活子、终止剂、诱导剂和RBSs,有能力提供各种水平的蛋白表达。目前,在学术界和生物制药界,使用大肠杆菌系统,密码子优化基因被广泛的应用于表达研究和外源蛋白的有效生产。
    与十年前相比,合成基因没有表现出优势,并且大量的 DNA合成片段可以根据需求被改造。进一步讲,它们可以组装成一个完整的基因用于克隆。密码子的优化方法可以使蛋白表达水平提高几倍。密码子的最优化过程或生物合成路径的重新设计促进重组蛋白和代谢产物的体积产量。这可促进低成本过程和产品的生产。此外,它还影响生物技术的经济学可行性。
                                                                                                                                    表2 工业化重组蛋白制品



                                                                                                       图2  在大肠杆菌中的过程和产量的技术创新的建议流程




                                                                                                                                 表3  先进技术的优缺点




    用新型的启动子来提高表达
    在原核宿主中高表达重组蛋白是一个主要突破。T7噬菌体聚合酶识别T7噬菌体启动子系统(T7 p/p系统)广泛应用于原核系统载体元素来制备蛋白制品。然而观察到,当使用这种聚合酶和启动子系统3-5代后,蛋白制品的表达量逐渐降低。为了克服这个难题,应用了很多策略,遗憾的是没有被充分证明有效的方法。在很多情况下,这个表达系统很好,并且表达出的目标蛋白占总细胞蛋白的50%以上。
    近来,启动子在大肠杆菌中用于表达外源蛋白,可有很高的蛋白产量。然而,这些启动子不能稳定的表达所需要的大量的重组蛋白。在多种情况下可以观察到蛋白表达量的降低,这会导致在工业生物制药中高的制造成本以及质量的不一致性。
    在连续培养中表达量降低的问题被一种新的策略所解决,表达T7C p/p系统,它可以从连续生长培养中去除不工作的细胞。这个系统不同于通常使用的启动子,在通常的启动子中,随着功能聚合酶、T7 RNA聚合酶启动子的丢失而诱导产生的死细胞,和其它的一些差错的发生,都会影响重组蛋白的表达。因此,含有目标基因的重组细胞可以在培养中维持,稳定的高水平蛋白表达可以实现。
    一个新型的T7C p/p系统已经在一个表达暗盒(名为ECKm暗盒)的基础上发展,这个表达暗盒是被一个T7启动子引入的表达载体所控制的。选择标记卡那霉素抗性诱导物基因编码APH与ECKm暗盒结合,用于克隆筛选和选择。转录终止序列被插入到APH基因的5,末端,用来聚合酶的选择标记卡那霉素的表达。非噬菌体启动子通过转录终止基因插入ECKm暗盒,来阻止选择标记的表达。因此,选择标记APH基因的表达严格的被T7-噬菌体启动子所控制,因此新型的暗盒表现出所需的特征。新型的结构设计促进了大肠杆菌表达平台中目标蛋白的蛋白生产效率以及成本的竞争。
    进一步讲,大量的实验用来评估新型的启动子系统,都成功实现了高水平长周期的蛋白表达,而且没有任何缺陷。这种新型的启动子T7C p/p系统是用于增强已经被广泛应用的T7-phage RNA 聚合酶/T7 启动子基础表达系统。这种新型的启动子系统可以大大提高重组蛋白的产量,无论是在小规模还是在放大规模,无论在学术界还是在工业级生物制药界。新型启动子系统的应用还可以降低纯化成本。
    Cumate 诱导型 一种新型的表达系统
    一种尝试向重组蛋白制备的挑战,各种载体和表达系统都发展起来。一种更好的启动子可以增强大肠杆菌RNA的转录,是通过更换通常所用的T7噬菌体或其它启动子来完成的。一个稳定结构或严格控制的启动子,目标基因可以在上游克隆,可达到高水平蛋白产量。一种自诱导启动子也可用于大肠杆菌中稳定基因的发展和蛋白的表达。
    近来,一些新型的严格控制的载体系统已经应用于大肠杆菌中高水平表达蛋白,其中,Pseudomonas putida F1 cym 和 cmt操纵子标准元素被应用。通过使用化学诱导剂cumate,这两种操纵子控制目标基因的表达在转录调节水平。与IPTG不同,一种无毒的化学诱导剂cumate在表达暗盒中诱导基因的转录组装。一种特殊的pNEW载体被创造用于蛋白表达,这种载体使用cumate基因开关,包含一个局部的T5噬菌体启动子结合一个合成的操纵子以及目的基因的组成结构表达的抑制物蛋白cymR。
    Cumate表达系统有很多优势,比如1:与IPTG诱导pET表达系统相比有更高的产量;2、严格规定的基因表达;3、充分的诱导以及均匀的蛋白制备;4、使用不同浓度的Cumate进行表达优化;5、由于诱导后8h细胞仍然被诱导,所有高产量。
    pET-based IPTG诱导系统相比,Cumate-based pNew载体可以有3-6倍的表达量。在工业化蛋白和酶方面,这个系统提供改进的和更高水平的表达量。提高了的表达量可以减少发酵、纯化、原材料消耗花费。
    关于大肠杆菌工程中二硫键的形成及糖基化
    在任何蛋白中蛋白的折叠和二硫键的正确连接对于蛋白的稳定和生物学功能都是十分重要的,蛋白的正确折叠取决于二硫键的连接,这在重组制品的翻译后修饰方面是十分重要的。二硫键的形成和正确折叠在真核(酵母、昆虫、哺乳动物)细胞中更加高效。在大肠杆菌的周质空间中,正确二硫键的形成需要一个氧化还原环境,例如在大肠杆菌的周质空间中存在二硫化物异构酶(Dsb蛋白)和PP异构酶(PPIase)。这些都可以促进目标蛋白形成正确的二硫键。
    在大肠杆菌中获得二硫键蛋白是通过在重组蛋白的N端编入各种信号肽,通过大肠杆菌分泌途径(SEC)依赖途径或者信号识别颗粒(SRP)依赖移位机制,将外源蛋白转移至大肠杆菌细胞的周质腔或保外环境中。大肠杆菌周质腔中外源蛋白的正确折叠可以通过:分子伴侣的联合表达、蛋白二硫键异构酶(PDIs 或PPIases)和二硫键形成催化剂(Dsbs)来增强。分子伴侣的联合表达以及Dsbs和PDIs的存在可以促进生物活性产量的提高以及蛋白的正确折叠。转基因宿主在大肠杆菌中正确折叠蛋白的表达方面具有商业化价值。
    大肠杆菌的糖基化在宿主细胞工程中是一个突破。空肠弯曲杆菌的N端糖基化系统,并将它转移至大肠杆菌,可以将蛋白简单糖基化。某某通过结合pgl途径,成功的在大肠杆菌中制备了糖基化重组蛋白。Pgl是弯曲杆菌中一个被识别的基因簇,在其中,第一次发现原核N连接蛋白糖基化。同样的方法可以应用于单克隆抗体、抗体片段和其它重组蛋白的N端糖基化。
    使用信号序列来增强细胞分泌效率
    至今,很多重组蛋白都是在大肠杆菌的胞外环境或周质腔中表达。为了将重组蛋白从胞内转运,它们被设计成沿着N端信号肽表达,这样表达的蛋白可以通过宿主转移子转移至以上环境中。
    分泌的信号肽(SPs)是一种以蛋白为靶向的被熟知的序列,可以在真核系统中将蛋白通过内质网和高尔基体膜运输。通过大肠杆菌的分泌途径转移位置后,大部分蛋白被分泌到培养上清液中,但是由于缺少分泌机制,蛋白通常以聚体或包涵体的形式累积在细胞中。因此,通过细胞设计或使用信号序列,可能会在大肠杆菌的周质空间或胞外环境指导蛋白的表达。
    信号肽的设计对于在大肠杆菌中重组蛋白、小肽、抗体片段的表达效率和分泌是十分重要的。已经证明,设计的蛋白从SAP1天然信号序列的C区域导致不同的表达分泌速率。也证明了,重组蛋白的总产量可以通过优化大肠杆菌的信号系列来增加。细菌种属G1的一个外源信号肽被优化表达环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)至大肠杆菌的周质腔和胞外环境中。为了优化更高的蛋白产量,8个信号序列的突变体与CGTase基因一起被创造和克隆,用来为周质腔和胞外表达评估和鉴定一个最佳的信号序列。于野生型序列相比,这个信号序列突变体分别引起94%和110%胞外和周质的蛋白分泌。这个信号序列在正确折叠的蛋白的表达效率方面也有潜力。
    一个最新发展起来的ESETEC Wacker’s分泌技术是一个新型分泌平台的很好例子,它可以在大肠杆菌的胞外环境中制备大量的重组蛋白。这个系统证明,新颖和高效使得天然形态蛋白的分泌以及正确折叠的重组制品分泌至胞外环境,可以促使下游过程低成本的发展。当使用ESETEC Wacker’s分泌技术时,生物活性重组ScFv 和Fab的纯化产量分别为3.5g/L和4.0g/L,与之相比,当使用不同的克隆策略、菌株和培养条件时,纯化产量仅为0.5 mg/L 至400 mg/L。
    ESETEC系统基于2步输出机制:1、目标产物通过2步路径转移至周质空间;随后,信号肽裂解,原始产物释放出来;2、正确折叠的产物由周质空间转移至胞外环境。在培养中获得高产量7.0g/L的高纯度分泌蛋白。当优化的条件提供给罗曼士(DE3)菌株时,通过DsbA衍生信号序列装配的小片段蛋白也以分泌的形式表达。
    各种革兰氏阳性菌被也用来分泌重组蛋白,包括胞外环境的小抗体片段。由于外膜的缺失,直接分泌重组蛋白到培养基中,这反而会促进发酵规模的放大和降低成本。
    Pfenex表达系统
    如前面段落所描述,随着多二硫键作为分泌产物,重组蛋白的制备十分困难,并且在大肠杆菌平台是一项挑战性工作。为了克服这个困难,Pfenex开发了一种综合性的基于荧光假单胞杆菌的蛋白制备平台,可成功的用于制备高产量的功能蛋白。荧光假单胞杆菌的新型的基因修饰菌株库已经被用于高通量筛选和重组抗体片段的制备。这个菌种库包含上千种由大量基因片段编入宿主菌构建的基因设计的P. fluorescens表达菌株。在选择菌株上的大量的筛选和鉴别实验,可以为发酵和功能性治疗蛋白的制备鉴别出最终的菌株。菌株筛选和发酵过程大约4周完成,并可成功获得超过1.0g/L功能Fab。
    折叠酶和分子伴侣的协同表达
    大肠杆菌中重组蛋白的过表达经常导致错误折叠的蛋白以包涵体的形式积累。以前的研究证明,大肠杆菌中蛋白的折叠式一个能量依赖过程,通过两级分子伴侣来调整:DnaK-DnaJ-GrpE 和GroEL-GroES系统,这可以抑制表达蛋白的聚集以及促进正确的蛋白折叠。这些伴侣可以控制很多细胞机制,如大肠杆菌的基因转录,蛋白装配和膜运输,以及促进表达,纯化和外源蛋白的折叠。
    分子伴侣是一种折叠酶,来促进蛋白折叠和正确结构的形成。为了防止形成包涵体和促进蛋白的形成,分子伴侣用来协同表达。这些伴侣通过插入表达的蛋白来触发蛋白折叠,并为正确的折叠和蛋白结构形成蛋白伴侣复合体。
    近来,在大肠杆菌中表达人ALDH3A1角膜晶体蛋白十分困难,这是由于它的低溶解性、低产量和不够高的纯度。因此,为了促进重组ALDH3A1的溶解性和表达,蛋白被融合了6个his标签并与两组分子伴侣:GroES/GroEL 和 DnaK/DnaJ/GrpE.共表达。结果,在大肠杆菌中,大量的可溶蛋白和活性的重组ALDH3A1蛋白被制备出来。
    近几年,一种基于大肠杆菌的无细胞表达系统被试着作为一种替代系统,被用来克服基于细胞的表达方法带来的限制,这是由于无细胞系统与基于细胞的系统相比,制备功能蛋白更加简单和经济。大肠杆菌无细胞系统可以制备出可达到1.0mg/ml的合成蛋白。然而,在无细胞系统中合成的高浓度的功能性Fab,据报道目前为止产量仅为30微克/ml。为了促进可溶的和功能性的Fab片段的合成,在系统中加入大肠杆菌伴侣(GroE 和DnaK)以及蛋白二硫键异构酶(PDI)。进一步,为了使无细胞系统更加经济可行,需要进一步大量的实验。
    LEA肽的联合表达
    一种最近的胚胎发育重组的LEA类似肽被用来增强在大肠杆菌中联合表达重组蛋白。这种LEA蛋白是亲水性和天然的非聚合型的,它可以防止大肠杆菌表达的其他目标蛋白聚体的形成。LEA肽被用来联合表达的研究,由11个氨基酸残基组成,可以显著增强目标蛋白的表达。在大肠杆菌中,GFP蛋白与LEA肽结合或者不结合,可以提高蛋白表达量到50%。
    -5和-3端标签
    大肠杆菌系统中一个主要的挑战是表达出的蛋白以不可溶聚合物包涵体的形式累积和表达的量很低,这是由于表达的蛋白在细胞质中的错误折叠。为了克服以上问题,大量的蛋白标签被用来评估降低聚体的形成以及蛋白以可溶的形式表达。融合标签常被用于改善蛋白的可溶性和纯化过程。在克隆设计中,这些标签常被融合在目标蛋白的N端或者C端。然而,在蛋白生产中的主要挑战是在纯化的不同步骤中,如何将融合标签裂解和去除。为了实现这个目的,多种酶切位点被设计出来,以便正确的蛋白表达和裂解。
    多种蛋白标签(His6, GST, MBP, NusA, Trx 和SUMO)可能作为融合标签,在大肠杆菌中被用于制备可溶的、有活性的或部分活性的蛋白。 His标签(包含6各或更多连续的组氨酸残基)是一种广泛应用的标签,被有效的应用于融合蛋白的亲和纯化。随后的表达,融合蛋白使用Ni-NTA亲和纯化系统被纯化,His-标签在之后的步骤中被蛋白酶移除。
    第二种融合标签SUMO被用于在大肠杆菌和高等真核生物中可溶性蛋白的表达,这可大量提高在大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞平台中,蛋白产量,折叠和目标蛋白的可溶性。SUMO融合物可将重组肽和重组蛋白的产量提高5-50倍。这种可溶蛋白很容易被纯化,而且使用SUMO蛋白酶很容易被去除。
    已经证明,在大肠杆菌胞内表达的,融合了His和SUMO标签的肽,可以使用SUMO蛋白酶-1被完全去除。另外一种基因工程标签(HaloTag7),已经被证明可以提高细菌中可溶性蛋白的表达。HaloTag7被评估可以在大肠中表达大约23中人蛋白,其中的74%以可溶的形式表达。使用His和SUMO标签克隆出骨形态蛋白14(BMP-14),并以可溶的形式在大肠杆菌中成功的表达出来。这种蛋白在随后的纯化中使用Ni-IDA层析纯化,纯度可达90%。这种SUMO标签在大肠杆菌中表达重组肽和蛋白中都是高效的。
    新型的标签Fh8(Histag)是一种具有潜力的标签,可用于增强重组蛋白的可溶性以及粗纯。Fh8是一种低分子量标签,在重组蛋白的制备中,可被当做高分子量融合标签应用。在Fh8最初的研究中显示,与不使用融合标签的蛋白制备相比,使用此融合标签的蛋白表达量是3-16倍。进一步的研究,Fh8融合技术证明,与其他普遍使用的融合标签(MBP、NusA、Trx)相比,融合了这种标签的融合蛋白可以得到更高的产量。
    其他融合标签,如TrpLE,类固醇异构酶,PurF和PagP被用于不可溶的表达。这种融合物可引导宿主细胞表达的蛋白成为多种包涵体形式,并且使用常用的裂解剂后容易被溶解和纯化。随后,使用洗涤剂或金属离子催化肽键裂解剂,这些标签可以被移除。
    大肠杆菌过程优化
    大肠杆菌系统中培养基、种子和发酵参数的优化,需要培养成分和生物过程参数的大量积累。蛋白生产中的碳源是一种主要的培养成分,它可以影响细胞代谢和蛋白产量。培养基中碳源和其副产物在目标基因的转录和翻译方面发挥了重要的作用。通过降低酶的合成,碳源提供了优良的生长。
    培养基中副产物醋酸盐的累积引起了低水平的重组酶和蛋白制备。为了避免培养基中醋酸的积累,细胞在一个相对较低的生长速率,这反而会引起一个高的细胞蛋白浓度。醋酸的累积可以通过在微生物培养中将葡萄糖维持在一个最优的水平来控制,在培养中将醋酸的累积维持在低水平,可以维持pH并可将细胞和蛋白浓度达到高水平。进一步讲,通过优化基础培养基、种子和发酵参数设置,一个粗的连续的补料过程可以被改善。通过基础培养基,初始细胞生长和蛋白制备可以完成,但在fed-batch过程中,营养物耗尽及细胞的持续生长是通过补加补充物来完成的。
    已经证明,大肠杆菌培养基的优化可使工业化木聚糖酶高产。一个2L规模搅拌式罐发酵结合培养基组分的优化被用于评估在大肠杆菌DH5α中木聚糖酶的生产。葡萄糖和硫酸铵浓度的优化使木聚糖酶生产具有最优的参数,并且发现10g/L葡萄糖和2g/L硫酸铵浓度是木聚糖酶生产的最优浓度。最优的培养基组分和溶氧水平,十分在大肠发酵制备木聚糖酶达到一个更高的水平。
    发酵过程发展的最大挑战是,补料策略及放大过程参数的优化,而重组蛋制品产量和质量没有明显改善。在早期的开发中,在小规模试管和烧瓶中进行发酵过程的优化。然而,当过程放大并在受控的发酵环境中进行重现时,有很多限制和缺陷。为了解决这个难题,某某引进了一种新型的小型24微型反应器系统,它比摇瓶、大规模常规的发酵具有多种优点。这种24孔反应器近来被用于培养基和种子的筛选,参数的优化和克隆筛选。24孔微型反应器的应用可节省时间和成本。
    最近,突变的AvPAL基因的制备通过优化培养条件被增加。AvPAL的突变体在Novagen’s pET28a表达载体中被克隆,并为蛋白的制备提供了一个合适的培养条件。培养参数,如诱导剂IPTG的各种浓度,诱导时间和生长温度,搅拌转速和各种类型、来源的培养基被用来评估最优的表达。通过研究这些参数,培养温度(25℃)和IPTG浓度(0.5mM)可在大肠中促进突变体AvPAL的制备。
    一个类似的方法被用来在大肠中优化制备真核酶制备。初始种子密度,培养温度和诱导持续时间被评估,可使得重组酶的高表达。当培养使用IPTG诱导,在OD600=0.1,并且诱导温度为4℃,48-72h时,可获得大约3倍的产量。这个方法可以用于在高温时容易失活的温度敏感蛋白的制备上。
    小结
    重组DNA技术在微生物技术中制备酶和生物治疗性制品方面是一种非常有效的技术。随着各种新型表达技术的进步,如启动子、宿主修饰、分泌信号和过程优化,在短时间和低成本下制备克级产量的蛋白变得容易。新型技术的应用,使得高产、低成本工业化制备治疗性和非治疗性制品变成可能。与广泛应用的工业化标准pET表达系统相比,pNew载体的引入可获得3-6倍的表达量,这个表达平台还可用于制备难于表达的复合和融合蛋白。Wacker的新型分泌技术可促进胞外蛋白的表达;一种可溶的和正确折叠的蛋白可以通过Wacker的修饰的菌株获得高产(可达7.0g/L)。通过各种融合体的加入,包括Fh8,在大肠中制备可溶蛋白是很有帮助的。以上的方法可降低纯化和整个蛋白制备过程的消耗。
    此外,小型多孔生物反应器的应用,可以在有限的时间和资源内提高克隆筛选速率和优化上游过程。因此,表达平台,宿主,载体的选择和发酵过程的优化在重组蛋白的制备发展中起到关键作用。
    重点  
    这个广泛评论的“顶尖”的在细菌中促进重组蛋白表达的先进技术,我们已经在于印度合作的生物技术工业化产业中完整的应用。这个努力在我们对这个技术的重要性的认识方面是有益的。本文揭示了这个新型的平台在高通量研究中应用的根本优势。
    关键亮点如下:
    1、 新型表达技术在大肠杆菌中改进蛋白的制备中被描述为低成本、高通量的蛋白工程。
    2、 微生物系统中密码子优化基因的表达是与它们的启动子和特殊性能相辅相成的。
    3、 详细介绍了cumate诱导新型表达系统的前景。
    4、 有关大肠杆菌中的二硫键结构和糖工程的概念,通过适当的例子被很好的定义,并更好的理解了这个技术。
    5、 新技术概念应用于高产的和低成本的工业化治疗性和非治疗性产品,具有重要的工业化价值。
    6、 pNew载体和Wacker新型分泌技术的应用,与广泛应用的工业化标准的pET表达系统相比,具有更高的胞外蛋白的表达。
    7、 具有特殊性能的多种pET载体以及其应用具有重要的研究价值。
    本文描述了在大肠中提高外源蛋白表达技术方面的进展,其应用在微生物学和制药学方面是十分重要的。
    参考文献:
    Gupta SK, Shukla P.Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications.Crit Rev Biotechnol. 2016 Dec;36(6):1089-1098.


    备注:此文为转载

    本帖子中包含更多资源

    您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

    x
    回复

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    奋斗
    昨天 09:34
  • 签到天数: 49 天

    [LV.5]常住居民I

    32

    主题

    183

    帖子

    542

    积分

    超级版主

    Rank: 20Rank: 20Rank: 20Rank: 20

    积分
    542
    发表于 2018-9-17 08:21:26 | 显示全部楼层
    这是IVD领域的知识还是医学知识?
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    奋斗
    昨天 09:34
  • 签到天数: 49 天

    [LV.5]常住居民I

    32

    主题

    183

    帖子

    542

    积分

    超级版主

    Rank: 20Rank: 20Rank: 20Rank: 20

    积分
    542
    发表于 2018-9-17 08:21:26 | 显示全部楼层
    这是IVD领域的知识还是医学知识?
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    开心
    12 小时前
  • 签到天数: 49 天

    [LV.5]常住居民I

    43

    主题

    165

    帖子

    434

    积分

    版主

    Rank: 13Rank: 13Rank: 13

    积分
    434
    发表于 2018-9-17 19:04:13 | 显示全部楼层
    多阅读,涨知识
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    奋斗
    2 小时前
  • 签到天数: 14 天

    [LV.3]偶尔看看II

    24

    主题

    68

    帖子

    216

    积分

    超级版主

    Rank: 20Rank: 20Rank: 20Rank: 20

    积分
    216
     楼主| 发表于 2018-9-30 10:00:41 | 显示全部楼层
    尘封的美好1009 发表于 2018-9-17 08:21
    这是IVD领域的知识还是医学知识?

    IVD 的上游原料制备技术
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

  • TA的每日心情
    奋斗
    昨天 09:34
  • 签到天数: 49 天

    [LV.5]常住居民I

    32

    主题

    183

    帖子

    542

    积分

    超级版主

    Rank: 20Rank: 20Rank: 20Rank: 20

    积分
    542
    发表于 2018-9-30 15:31:39 | 显示全部楼层
    zhao2012 发表于 2018-9-30 10:00
    IVD 的上游原料制备技术

    哦哦哦,学习了
    回复 支持 反对

    使用道具 举报

    您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

    本版积分规则

    客服热线
    QQ:2394554903周一至周日:09:00 - 21:00
    公司地址:苏州工业园区顺达商业广场1幢

    优米医谷是一个旨为人类健康服务,专注于医疗行业的共享平台!

    Powered by Discuz! X3.4 © 2001-2013 Comsenz Inc.

    Archiver|手机版|小黑屋|优米医谷. ( 苏ICP备18031907号 )

    GMT+8, 2018-10-16 12:19 , Processed in 0.196060 second(s), 36 queries .

    快速回复 返回顶部 返回列表